Neutrophils (1x10^6 cells / ml) wer

Neutrophils (1x10^6 cells / ml) were incubated in 1 ml of KRP containing 1
mmol / l CaCl , 10 mmol / l glucose and 0–100 mmol / l of timosaponins E1 and
2E2 for 3 min at 37C, and then 0.5 ml of ice-cold 45% trichloroacetic acid (final
concentration, 15%) containing 1 mmol / l sodium vanadate and 2 mmol / l
phenylmethylsulfonylfluoride was added to stop the reaction. After incubationfor 30 min at 4C, the mixture was centrifuged at 10,000gfor 15 min at 48C.
The precipitate was washed twice with ice-cold diethyl ether–ethanol (1:1, v / v),
dissolved in 50 ml of 62.5 mmol / l Tris–HCl (pH 6.8) containing 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.7 mol / l b-mercaptoethanol and 10% glycerol and was
subjected to SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) using a 7.5% gel [24]. The electrophoresed proteins were transferred onto Immobilon-P membranes (Nippon Millipore) using a semidry blotting apparatus (Sartorius) 2 for 60 min at 2 mA / cm , and the tyrosyl phosphorylated proteins were detected using phosphotyrosine-specific monoclonal antibody (PY-20; ICN Biochemi-cals), peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse immunoglobulin G antibody (E.Y.Laboratories) and the ECL Western Blotting Detection System (Amersham, Japan) [21]. The apparent molecular masses of the proteins were determined using prestained molecular weight standards (14,300–200,000 molecular weight
range; Gibco–BRL). To estimate the phosphorylation level, the lanes were scanned using an Epson GT 8000 (Seiko Epson Co., Japan) and the intensity of the 58 kDa band was analysed using NIH Image software (Nayne Rasband, National Institute of Health, USA)

Kết quả (Việt) 1:

Bạch cầu trung tính (1 x 10 ^ 6 các tế bào / ml) đã được ủ trong 1 ml chứa 1 KRPmmol / l CaCl, 10 mmol / l glucose và 0-100 mmol / l timosaponins E1 và2E2 3 phút ở 37 C, và sau đó cách 0.5 ml lạnh 45% Axit tricloaxetic (trận chung kếtnồng độ, 15%) có chứa 1 mmol / l natri vanadat và 2 mmol / lphenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ngăn chặn các phản ứng. Sau khi incubationfor 30 phút tại 4C, hỗn hợp được ly lúc 10, 000gfor 15 phút 48 c.Precipitate đã được rửa sạch hai lần với lạnh dietyl ete-ethanol (1:1, v / v),hòa tan trong 50 ml 62.5 mmol / l Tris-HCl (pH 6.8) chứa 2% natri dodecyl sulfat (SDS), cách 0.7 mol / l b-mercaptoethanol và 10% glycerol vàphải chịu SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-trang) bằng cách sử dụng một 7.5% gel [24]. Các protein electrophoresed đã được chuyển giao vào màng Immobilon-P (Nippon Millipore) bằng cách sử dụng một bộ máy nên thấm (Sartorius) 2 trong 60 phút tại 2 mA / cm và protein tyrosyl phosphorylated đã được phát hiện bằng cách sử dụng cụ thể phosphotyrosine monoclonal kháng (PY-20; ICN Biochemi-Cal), chia peroxidase thỏ kháng thể chống chuột globulin miễn dịch G (E.Y.Laboratories) và ECL Tây thấm phát hiện hệ thống (Amersham, Nhật bản) [21]. Khối lượng phân tử rõ ràng của các protein đã được xác định bằng cách sử dụng tiêu chuẩn trọng lượng phân tử prestained (trọng lượng phân tử 14,300-200.000phạm vi; Gibco–BRL). Để ước lượng mức độ phosphorylation, các tuyến đường đã được quét bằng cách sử dụng một Epson GT 8000 (Seiko Epson Co., Nhật bản) và cường độ của các ban nhạc 58 kDa được phân tích bằng cách sử dụng phần mềm hình ảnh NIH (Nayne Rasband, viện sức khỏe, Hoa Kỳ)

Kết quả (Việt) 2:

Bạch cầu trung tính (1x10 ^ 6 tế bào / ml) được ủ trong 1 ml KRP chứa 1
mmol / l CaCl, 10 mmol / l glucose và 0-100 mmol / l của timosaponins E1 và
2e2 trong 3 phút ở 37C, và sau đó 0,5 ml 45% axit băng lạnh tricloaxetic (thức
tập trung, 15%) có chứa 1 mmol / l natri vanadate và 2 mmol / l
phenylmethylsulfonylfluoride đã được bổ sung để ngăn chặn các phản ứng. Sau 30 phút incubationfor tại 4C, hỗn hợp được ly tâm ở 10,000gfor 15 phút ở 48C.
Kết tủa được rửa sạch hai lần với nước đá lạnh diethyl ether-ethanol (1: 1, v / v),
hòa tan trong 50 ml 62,5 mmol / l Tris-HCl (pH 6.8) có chứa 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0,7 mol / l b-mercaptoethanol và glycerol 10% và đã được
chịu SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) sử dụng một loại gel 7,5% [24 ]. Các protein electrophoresed đã được chuyển lên màng Immobilon-P (Nippon Millipore) sử dụng một thiết bị thấm semidry (Sartorius) 2 cho 60 phút ở 2 mA / cm, và các protein phosphoryl tyrosyl đã được phát hiện sử dụng pyruvate cụ thể kháng thể đơn dòng (PY-20; ICN Biochemi-CALS), peroxidase liên hợp thỏ chống chuột immunoglobulin G kháng thể (EYLaboratories) và ECL Tây Blotting Detection System (Amersham, Nhật Bản) [21]. Các khối lượng phân tử biểu của các protein được xác định bằng các tiêu chuẩn trọng lượng phân tử prestained (14,300-200,000 trọng lượng phân tử
khoảng; Gibco-BRL). Để ước tính mức độ phosphoryl hóa, làn đường đã được quét bằng một Epson GT 8000 (Seiko Epson Công ty Nhật Bản) và cường độ của các ban nhạc 58 kDa được phân tích bằng phần mềm NIH Image (Nayne Rasband, Viện Y tế Quốc gia, Mỹ)