8.4.2 Selection of Chromatographic

8.4.2 Selection of Chromatographic Mode
Table 8.3 lists some common chromatographic modes based on the analyte’s
molecular weight and polarity. All case studies will focus on reversed-phase
chromatography (RPC), the most common mode for small organic molecules.
Note that ionizable compounds (acids and bases) are often separated by RPC
with buffered mobile phases (to keep the analytes in a non-ionized state) or
with ion-pairing reagents.
8.4.3 Initial Selection of HPLC Column
Chapter 3 discusses the characteristics of columns and packing materials.
Although there is a wide choice of RPC-bonded phases on the market, a silicaINITIAL HPLC METHOD DEVELOPMENT 199
AU
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
0.045
0.050
0.055
0.060
0.065
nm
250.00 300.00 350.00
258.2
AU
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
0.040
nm
250.00 300.00 350.00
241.5
368.0
AU
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0.22
0.24
0.26
0.28
0.30
0.32
0.34
0.36
nm
250.00 300.00 350.00
212.2
268.7
338.7
?
210 - 230 nm
Figure 8.1.UV spectra of three analytes illustrating the decision process in setting HPLC
monitoring wavelength. (A) The λmaxat 241 nm is the clear choice. (B) The three λmaxat 212 nm,
269 nm, and 339 nm give rise to different possibilities: 269 nm is the obvious choice though
212 nm can be selected for higher sensitivity or 339 nm for higher selectivity if interference from
other matrix components is a problem. (C) The λmaxat 258 nm is a clear choice if sensitivity is
not an issue, otherwise the wavelength at far UV (210–230 nm) are better selection for higher
sensitivity. The actual choice in the far UV range is often dependent on baseline gradient shifts
due to the absorbance of the mobile phase at that the monitoring wavelength.
based C18 or C8 column remains a good starting point because of its high efficiency and stability. Additional guidelines for initial column selection follow.
Select columns packed with 3- or 5-µm high-purity silica-bonded phases from
a reputable manufacturer. Three-micrometer packing is probably preferable
due to its faster analysis since shorter column length can be used. However,
columns packed with sub-2-µm packing should be purchased with caution
since they are best used for clean samples on low-dispersion instruments. The
following column dimensions are suggested:
•
50–100 mm ×4.6 mm i.d. for simple samples (e.g., assays of the main
component)
•
100–150 mm × 3.0–4.6 mm i.d. for purity testing or multi-component
testing of complex samples
•
20–150 mm ×2.0 mm columns for LC/MS
Guidelines on mobile phase selection are discussed in Chapter 2, Section 2.3
and are illustrated in the case study below. After evaluation of the first sample
chromatograms, further method development to fine-tune the separation will
be performed until all method goals are achieved. Other bonded phases or
column configurations can be selected to enhance method performance.These
are discussed in the Section 8.6.
8.4.4 Generating a First Chromatogram
8.4.4.1 Case Study: Initial Method Development Using a Broad Gradient and Mobile Phase Selection In this case study, a broad scouting gradient is used to obtain the first sample chromatogram. The method goal is to
develop an MS-compatible composite method (combined assay and impurity)
for a drug substance. This pharmaceutical active ingredient (API) is a basic
200

Kết quả (Việt) 1:

8.4.2 lựa chọn chế độ Chromatographic8.3 bảng liệt kê một số chế độ chromatographic phổ biến dựa trên analytetrọng lượng phân tử và phân cực. Tất cả các nghiên cứu trường hợp sẽ tập trung vào giai đoạn đảo ngượcsắc ký (RPC), chế độ phổ biến nhất cho các phân tử hữu cơ nhỏ.Lưu ý rằng hợp chất ionizable (axit và bazơ) thường được phân tách bằng RPCvới đệm các giai đoạn di động (để giữ cho các analytes trong trạng thái không ion hóa) hoặcvới ion kết nối thử.8.4.3 ban đầu lựa chọn của các cột HPLCChương 3 thảo luận về các đặc tính của cột và các vật liệu đóng gói.Mặc dù có nhiều lựa chọn RPC ngoại quan giai đoạn trên thị trường, một silicaINITIAL phương pháp HPLC phát triển 199AU0,0000,0050.0100.0150.0200.0250.0300,0350,0400.0450,0500.0550.0600,065nm250,00 300.00 350,00258.2AU0,0000,0050.0100.0150.0200.0250.0300,0350,040nm250,00 300.00 350,00241.5368.0AU0,040,060,080,100,120,140,160,180.200,220,240,260,280,300,320,340,36nm250,00 300.00 350,00212.2268.7338.7?210 - 230 nmQuang phổ 8.1.UV hình của ba analytes minh họa quá trình quyết định trong việc thiết lập hệ HPLC theo dõi bước sóng. (A) λmaxat 241 nm là sự lựa chọn rõ ràng. (B) ba λmaxat 212 nm,269 nm và 339 nm cho tăng khả năng khác nhau: 269 nm là sự lựa chọn rõ ràng mặc dù 212 nm có thể được chọn cho độ nhạy cao hoặc 339 nm cho chọn lọc cao hơn nếu sự can thiệp từCác thành phần khác của ma trận là một vấn đề. (C) nm λmaxat 258 là một sự lựa chọn rõ ràng nếu nhạy cảmkhông phải một vấn đề, nếu không các bước sóng tại xa UV (210-230 nm) là sự lựa chọn tốt hơn cho cao hơnđộ nhạy cảm. Sự lựa chọn thực tế trong phạm vi xa UV thường là phụ thuộc vào cơ sở thay đổi gradientdo sự hấp thu của điện thoại di động giai đoạn mà các bước sóng giám sát.Dựa trên cột C18 hoặc C8 vẫn còn một điểm bắt đầu vì hiệu quả cao và sự ổn định của nó. Thực hiện theo các hướng dẫn bổ sung cho lựa chọn ban đầu cột.Chọn cột đóng gói với 3 hay 5 μm độ tinh khiết cao silica ngoại quan giai đoạn từmột nhà sản xuất có uy tín. Panme đo ba bao bì là có lẽ thích hợp hơndo phân tích nhanh hơn kể từ cột ngắn hơn chiều dài có thể được sử dụng. Tuy nhiên,cột đóng gói với các sub-2-μm bao bì nên được mua cẩn thậnkể từ khi họ là tốt nhất được sử dụng cho sạch mẫu trên thiết bị tán sắc thấp. Cácsau cột kích thước được đề nghị:•50-100 mm × 4,6 mm ID cho các mẫu đơn giản (ví dụ: thử nghiệm của chính thành phần)•100 – 150 mm x 3.0-4.6 mm ID để thử độ tinh khiết hay đa thành phầnthử nghiệm các mẫu phức tạp•20-150 mm × 2.0 mm cột LC/MSCác hướng dẫn trên điện thoại di động giai đoạn lựa chọn được thảo luận trong chương 2, phần 2,3và được minh họa trong nghiên cứu trường hợp dưới đây. Sau khi đánh giá về mẫu đầu tiênchromatograms, hơn nữa phương pháp phát triển để tinh chỉnh việc chia sẽđược thực hiện cho đến khi đạt được tất cả phương pháp mục tiêu. Giai đoạn kho ngoại quan khác hoặccấu hình cột có thể được chọn để tăng cường các phương pháp hiệu quả. Nhữngđược thảo luận trong phần 8.6.8.4.4 tạo ra một Chromatogram đầu tiên8.4.4.1 Case Study: phương pháp phát triển ban đầu của bạn bằng cách sử dụng một rộng Gradient và điện thoại di động giai đoạn lựa chọn trong nghiên cứu này, một gradient rộng hướng đạo được sử dụng để có được chromatogram mẫu đầu tiên. Mục tiêu của phương pháp làphát triển một tương thích với MS tổng hợp phương pháp (kết hợp khảo nghiệm và tạp chất)cho một chất ma túy. Thành phần này hoạt động dược phẩm (API) là một cơ bản200

Kết quả (Việt) 2:

8.4.2 Lựa chọn các sắc ký Chế độ
Bảng 8.3 liệt kê một số chế độ sắc ký phổ biến dựa trên của chất phân tích
trọng lượng và phân cực phân tử. Tất cả các trường hợp nghiên cứu sẽ tập trung vào giai đoạn đảo ngược
sắc ký (RPC), chế độ thông thường nhất cho các phân tử hữu cơ nhỏ.
Lưu ý rằng các hợp chất ionizable (axit và bazơ) thường được phân cách bằng RPC
với các pha di động đệm (để giữ cho các chất phân tích trong một phi trạng thái ion hóa) hoặc
với thuốc thử ion ghép nối.
8.4.3 Lựa chọn ban đầu của HPLC cột
Chương 3 thảo luận về những đặc điểm của các cột và các vật liệu đóng gói.
Mặc dù có một sự lựa chọn rộng của giai đoạn RPC-ngoại quan trên thị trường, một PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP silicaINITIAL HPLC 199
AU
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
0,045
0,050
0,055
0,060
0,065
nm
250,00 300,00 350,00
258,2
AU
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
0,025
0,030
0,035
0,040
nm
250,00 300,00 350,00
241,5
368,0
AU
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,22
0,24
0,26
0,28
0,30
0,32
0,34
0,36
nm
250,00 300,00 350,00
212,2
268,7
338,7
?
210-230 nm
Hình 8.1.UV phổ của ba chất phân tích minh họa quá trình ra quyết định trong việc thiết HPLC
bước sóng theo dõi. (A) Các λmaxat 241 nm là sự lựa chọn rõ ràng. (B) Ba λmaxat 212 nm,
269 nm và 339 nm làm tăng khả năng khác nhau: 269 nm là sự lựa chọn rõ ràng mặc dù
212 nm có thể được lựa chọn cho độ nhạy cao hơn hoặc 339 nm cho tính chọn lọc cao hơn nếu can thiệp từ các
thành phần ma trận khác là một vấn đề. (C) Các λmaxat 258 nm là một sự lựa chọn rõ ràng nếu nhạy cảm là
không phải là một vấn đề, ​​nếu không có bước sóng xa UV (210-230 nm) là lựa chọn tốt hơn cho cao
độ nhạy. Sự lựa chọn thực tế trong phạm vi UV đến nay là thường phụ thuộc vào sự thay đổi độ dốc ban đầu
do sự hấp thụ của pha động ở các bước sóng theo dõi.
Dựa C18 hoặc cột C8 vẫn còn là một điểm khởi đầu tốt vì hiệu quả cao và ổn định. Hướng dẫn bổ sung cho ban đầu theo lựa chọn cột.
Chọn cột đóng gói với 3 hoặc 5 mm có độ tinh khiết cao giai đoạn silica-ngoại quan từ
một nhà sản xuất có uy tín. Ba-micromet đóng gói có lẽ thích hợp hơn
do phân tích nhanh hơn kể từ chiều dài cột ngắn hơn có thể được sử dụng. Tuy nhiên,
cột đóng gói với bao bì phụ-2-micron nên được mua thận trọng
kể từ khi chúng được sử dụng tốt nhất cho các mẫu sạch vào các công cụ phân tán thấp. Các
kích thước cột sau đây được đề nghị:
•
50-100 mm × 4.6 mm id cho các mẫu đơn giản (ví dụ, xét nghiệm của chính
thành phần)
•
100-150 mm × 3,0-4,6 mm id để kiểm tra độ tinh khiết hoặc nhiều thành phần
thử nghiệm mẫu phức tạp
•
20-150 mm × 2.0 mm cột cho LC / MS
Hướng dẫn về lựa chọn pha động được thảo luận trong Chương 2, mục 2.3
và được minh họa trong các nghiên cứu trường hợp dưới đây. Sau khi đánh giá các mẫu đầu tiên
sắc ký, phương pháp phát triển hơn nữa để tinh chỉnh việc tách sẽ
được thực hiện cho đến khi tất cả các mục tiêu phương pháp đạt được. Khác giai đoạn ngoại quan hoặc
cấu hình cột có thể được lựa chọn để nâng cao phương pháp performance.These
được thảo luận trong Phần 8.6.
8.4.4 Tạo ra một tiên sắc ký đồ
8.4.4.1 Trường hợp nghiên cứu: Phát triển ban đầu Phương pháp Sử dụng một Gradient rộng và giai đoạn lựa chọn di động Trong nghiên cứu trường hợp này , một gradient trinh sát rộng được sử dụng để có được trên sắc ký đồ mẫu đầu tiên. Mục tiêu là phương pháp để
phát triển một phương pháp tổng hợp MS-tương thích (kết hợp khảo nghiệm và tạp chất)
cho một chất ma túy. Thành phần hoạt chất dược phẩm này (API) là một cơ bản
200