Virus isolation in embryonated eggs

Virus isolation in embryonated eggs
Reverse transcription-polymerase chain reaction
After thawing, total RNA was isolated from the tissue samples, the
faeces (stored in TRIzol® Reagent) and from clarified allantoic fluid
samples. Briefly, 100 mg tissue, 50 m l of the faecal sample or 100 m l
allantoic fluid were homogenized in 300 m l TRIzol® Reagent with a
pestle in a 1.5 ml microtube (Piston Pellet Bleu avec microtube;
Polylabo SA, Geneva, Switzerland), then another 700 m l TRIzol®
Reagent was added. After vortexing, RNA extraction was performed
according to the manufacturer ’s protocol. RNA of each sample was
dissolved in 20 m l sterile RNAse-free water and either stored at –70°C
or directly used for RT-PCR.
The protocol for RT and PCR as described elsewhere (St¨auber et al.,
1995) was used with the following modifications. A different set of primers, NCD7/NCD8, was selected to amplify a 182 bp fragment of the
F0 gene including the cleavage site. Primer sequences were based on F0
gene alignment of 29 different NDV strains. For RT sense primer NCD7
(59 -CGIAGGATA-CAAGRGTCTG-39 ), corresponding to nucleotides
342 to 360 of the F0 gene, cDNA was used; for PCR antisense primer
NCD8 (59 -GCRGCAATGCTCTYTTTAAG-39 ), complementary to
nucleotides 503 to 523 of the F0 gene, cDNA was chosen. Primers were
synthesized by Microsynth, Balgach, Switzerland. For single-tube RTPCR,
2.5 m l RNA was used undiluted or 1:10 diluted in 10 mM Tris
buffer (pH 8.3), respectively, and added to 15 m l 2´ PCR buffer (50mM
Tris–HCl, pH 8.3, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2 , 500 m l of each dNTP),
17 m l H2O and 50 pmol primer NCD7, then heated to 95°C for 5 min and
subsequently chilled on ice. For RT, 50 U M-MLV reverse transcriptase
(GIBCO BRL), 10 U RNAse-inhibitor (RNAsin; Promega, Madison,
WI, USA) and a piece of pastillated paraffin wax (congealing point, 57 to
60°C; BDH Laboratory Supplies, Poole, UK) were added and the
mixture was incubated for 30 min at 37°C. The tubes were heated to 95°C
for 2 min and subsequently chilled on ice to form a wax barrier to allow
hotstart PCR and to inactivate the reverse transcriptase. After cooling,
0.5 U Taq DNA polymerase (Promega), 5 m l 2´ PCR buffer and 50 pmol
PCR primer NCD8 were overlaid on the solidified paraffin layer. The
amplification profile started with one denaturation step at 95°C for 1 min,
followed by 35 cycles of denaturation at 95°C for 15 s, annealing at 51°C
for 15 s and extension at 72°C for 15 s. Samples lacking specific
templates, either sterile RNAse free water or tissue samples from animals
slaughtered on day 0, were used as negative controls.
Sensitivity of RT-PCR
Tissue samples. To estimate the sensitivity of the RT-PCR in
comparison with virus isolation in embryonated eggs, tenfold dilution
series of tissue homogenate from kidney and lung from one animal
infected with APMV-1/chicken/Switzerland/Safnern/95, killed on day 5
p.i., were analysed by RT-PCR and compared with virus isolation in
embryonated chicken eggs, with subsequent NDV HA test.
Additionally, lung and kidney tissue from each of the 28 chickens
experimentally infected with APMV-1/chicken/Switzerland/Safnern/95
and the eight contact-infected chickens was analysed in parallel by RTPCR
and virus isolation in embryonated eggs.
Allantoic fluid or vaccines. Comparative NDV titration in allantoic
fluid used as inoculum for the time course experiment, containing
APMV-1/chicken/Switzerland/Safnern/95, was carried out by RT-PCR
and by inoculating in embryonated chicken eggs as already described.
Furthermore, tenfold dilution series of vaccines (TAD ND vac LaSota
and TAD ND vac HitchnerB1, according to the manufacturer ’s
specification containing at least 109 EID50 per 1000 infectious doses)
were used to determine the sensitivity of the RT-PCR.
In addition, harvested allantoic fluid from embryonated eggs,
inoculated with either vaccine TAD ND vac LaSota or APMV-
1/chicken/NorthernIreland/Ulster/2C, and tissue samples from chickens
experimentally infected with APMV-1/chicken/Switzerland/Safnern/
95, were analysed in two-fold dilution series by HA or RT-PCR
for NDV. Titres were compared.

Kết quả (Việt) 1:

Virus bị cô lập trong embryonated trứngPhản ứng chuỗi polymerase sao chép đảo ngượcSau khi tan, tất cả RNA được cô lập từ các mẫu mô, cácphân (được lưu trữ trong TRIzol ® tinh khiết) và từ làm rõ allantoic chất lỏngmẫu. Một thời gian ngắn, 100 mg mô, 50phút l của mẫu hoặc 100 m faecal lallantoic chất lỏng được homogenized trong 300 m l TRIzol ® tinh khiết với mộtpestle trong một microtube 1.5 ml (Piston miếng Bleu avec microtube;Polylabo SA, Geneva, Thụy sĩ), sau đó một 700 m l TRIzol ®Tinh khiết đã được bổ sung. Sau khi vortexing, khai thác RNA được thực hiệntheo giao thức của nhà sản xuất. ARN của mỗi mẫuhòa tan trong 20 m l RNAse miễn phí vô trùng nước và hoặc lưu trữ ở –70 ° Choặc trực tiếp được sử dụng cho RT-Đảng Cộng sản Romania.Giao thức cho RT và Đảng Cộng sản Romania như được diễn tả ở nơi khác (St¨auber et al.,1995) đã được sử dụng với các sửa đổi. Một bộ khác nhau của chất nền, mồi, NCD7/NCD8, đã được chọn để khuyếch đại một mảnh bp 182 của cácF0 gen bao gồm trang web cleavage. Chất mồi đệm chuỗi được dựa trên F0gen các liên kết của 29 chủng NDV khác nhau. Cho RT cảm giác mồi NCD7(59 - CGIAGGATA-CAAGRGTCTG-39), tương ứng với nucleotide342 để 360 của F0 gen, cDNA đã được sử dụng; cho Đảng Cộng sản Romania antisense mồiNCD8 (59 - GCRGCAATGCTCTYTTTAAG-39), bổ sung chonucleotide 503 để 523 của gen F0, cDNA đã được lựa chọn. Chất nền, mồiTổng hợp bởi Microsynth, Balgach, Thuỵ Sỹ. Đối với đơn-ống RTPCR,2,5 m l RNA được sử dụng undiluted hoặc pha loãng trong 10 mM Tris 1:10đệm (pH 8.3), tương ứng, và thêm vào 15 m l 2´ PCR đệm (50mMTris–HCl, pH 8.3, 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 500 m l của mỗi dNTP),17 m l H2O và 50 pmol mồi NCD7, sau đó đun nóng đến 95° C cho 5 phút vàsau đó ướp lạnh trên băng. Cho RT, 50 U M-MLV reverse transcriptase(GIBCO BRL), 10 U RNAse-chất ức chế (RNAsin; Promega, Madison,WI, Hoa Kỳ) và một mảnh sáp parafin pastillated (congealing điểm, 57 để60° C; Thiết bị phòng thí nghiệm BDH, Poole, Vương Quốc Anh) đã được bổ sung và cáchỗn hợp được ủ trong 30 phút ở 37° C. Các ống được đun nóng đến 95° Ccho 2 phút và sau đó ướp lạnh trên băng để tạo thành một rào cản sáp để cho phépHotStart Đảng Cộng sản Romania và để hủy kích hoạt transcriptase đảo ngược. Sau khi làm mát,0,5 U Taq DNA polymerase (Promega), 5 m l 2´ PCR đệm và 50 pmolĐảng Cộng sản Romania mồi NCD8 đã bị che khuất trên lớp kiên cố hóa parafin. Cáckhuếch đại hồ sơ bắt đầu với một denaturation bước tại 95° C trong 1 phút,tiếp nối bởi 35 chu kỳ của denaturation tại 95° C cho 15 s, làm cho deo lúc 51° C15 s và phần mở rộng ở 72° C cho 15 s. mẫu thiếu cụ thểmẫu, hoặc là vô trùng RNAse các mẫu nước hoặc mô từ động vật miễn phítàn sát ngày 0, được sử dụng như là tiêu cực điều khiển.Độ nhạy của RT-PCRMẫu mô. Để ước tính nhạy cảm của RT-PCR trongso sánh với virus bị cô lập trong embryonated trứng, pha loãng mười lầnloạt các mô homogenate từ thận và phổi từ một động vậtbị nhiễm APMV-1/gà/Thụy sĩ/Safnern/95, thiệt mạng vào ngày 5Pi, đã được phân tích bởi Đảng Cộng sản Romania RT và so với virus bị cô lập trongtrứng gà embryonated, với tiếp theo NDV HA kiểm tra.Ngoài ra, phổi và thận mô từ mỗi của các con gà 28thử nghiệm bị nhiễm APMV-1/gà/Thụy sĩ/Safnern/95và những con gà nhiễm bệnh liên hệ tám phân tích song song bởi RTPCRvà virus bị cô lập trong embryonated trứng.Allantoic chất lỏng hoặc vắc xin. So sánh các chuẩn độ NDV trong allantoicchất lỏng được sử dụng như là inoculum trong thời gian khóa học thử nghiệm, cóAPMV-1/gà/Thụy sĩ/Safnern/95, được thực hiện bởi Đảng Cộng sản Romania RTvà bởi cối trong trứng gà embryonated như đã mô tả.Hơn nữa, mười lần pha loãng loạt vắc xin (TAD ND vac LaSotavà TAD ND vac HitchnerB1, theo các nhà sản xuấtđặc điểm kỹ thuật có ít 109 EID50 mỗi liều 1000 truyền nhiễm)được sử dụng để xác định sự nhạy cảm của RT-PCR.Ngoài ra, thu hoạch các chất lỏng allantoic từ embryonated trứng,tiêm chủng với một trong hai vắc xin TAD ND vac LaSota hoặc APMV-1/gà/NorthernIreland/Ulster / 2C, và mẫu mô từ gàthử nghiệm bị nhiễm APMV-1/gà/Thụy sĩ/Safnern /95, được phân tích trong hai lần pha loãng loạt bởi Hà hoặc RT-PCRcho NDV. Titres đã được so sánh.

Kết quả (Việt) 2:

Phân lập virus trong trứng có phôi
khoản phản ứng phiên mã-polymerase chuỗi
Sau khi giải đông, tổng số RNA đã được phân lập từ các mẫu mô,
phân (được lưu trữ trong TRIzol® Reagent) và từ làm rõ allantoic dịch
mẫu. Tóm lại, mô 100 mg, 50 ml của mẫu phân hoặc 100 ml
allantoic chất lỏng đã được đồng nhất trong 300 ml TRIzol® Thuốc thử với một
cái chày trong 1,5 ml microtube (Piston Pellet Bleu microtube avec;
Polylabo SA, Geneva, Thụy Sĩ), sau đó một 700 ml TRIzol®
thuốc thử đã được bổ sung. Sau vortexing, chiết RNA được thực hiện
theo các giao thức của nhà sản xuất. RNA của mỗi mẫu được
hòa tan trong 20 ml nước vô trùng RNase-miễn phí và có thể được lưu trữ ở -70 ° C
hoặc sử dụng trực tiếp cho RT-PCR.
Các giao thức cho RT và PCR như mô tả ở nơi khác (Stauber et al.,
1995) là sử dụng với những sửa đổi sau. Một bộ khác nhau của mồi, NCD7 / NCD8, đã được chọn để khuếch đại một đoạn 182 bp của
gen F0 bao gồm cả vị trí phân cắt. Trình tự mồi dựa trên F0
chỉnh gene của 29 chủng NDV khác nhau. Đối với RT cảm giác mồi NCD7
(59 -CGIAGGATA-CAAGRGTCTG-39), tương ứng với nucleotide
342-360 của gen F0, cDNA được sử dụng; cho PCR mồi antisense
NCD8 (59 -GCRGCAATGCTCTYTTTAAG-39), bổ sung cho
nucleotide 503-523 của gen F0, cDNA đã được lựa chọn. Mồi được
tổng hợp bởi Microsynth, Balgach, Thụy Sĩ. Đối với đơn ống RTPCR,
2,5 ml RNA đã được sử dụng nguyên chất hoặc pha loãng 1:10 trong 10 mM Tris
đệm (pH 8.3), tương ứng, và thêm vào 15 ml 2'đệm PCR (50mM
Tris-HCl, pH 8.3, 150 mM KCl , 5 mM MgCl2, 500 ml của mỗi dNTP),
17 ml H2O và 50 pmol mồi NCD7, sau đó đun nóng đến 95 ° C trong 5 phút và
sau đó ướp lạnh trên băng. Đối với RT, 50 U M-MLV sao chép ngược
(Gibco BRL), 10 U-RNase inhibitor (RNAsin; Promega, Madison,
WI, USA) và một miếng sáp paraffin pastillated (-khả năng đông tụ điểm, 57 đến
60 ° C; Phòng thí nghiệm BDH Vật tư, Poole, Anh) đã được thêm vào và
hỗn hợp được ủ trong 30 phút ở 37 ° C. Các ống được đun nóng đến 95 ° C
trong 2 phút và sau đó ướp lạnh trên băng để tạo thành một rào cản sáp để cho phép
HotStart PCR và làm bất hoạt các enzyme sao chép ngược. Sau khi làm mát,
0,5 U Taq DNA polymerase (Promega), đệm PCR 5 ml 2'và 50 pmol
PCR mồi NCD8 được chồng lên lớp parafin kiên cố. Các
hồ sơ khuếch đại bắt đầu với một bước biến tính ở 95 ° C trong 1 phút,
tiếp theo là 35 chu kỳ của sự biến tính ở 95 ° C trong 15 s, ủ ở 51 ° C
trong 15 s và mở rộng ở 72 ° C trong 15 s. Các mẫu còn thiếu cụ thể
mẫu, hoặc là RNase nước tự do hoặc các mẫu mô vô trùng từ động vật
giết mổ vào ngày 0, được sử dụng như điều khiển âm.
Độ nhạy của RT-PCR
mẫu mô. Để ước tính nhạy cảm của RT-PCR trong
so sánh với phân lập virus trong trứng có phôi, pha loãng gấp mười
loạt của đồng bào từ thận và phổi từ một động vật
bị nhiễm APMV-1 / gà / Switzerland / Safnern / 95, bị giết vào ngày 5
pi , được phân tích bằng RT-PCR và so sánh với phân lập virus trong
trứng gà có phôi, với thử nghiệm tiếp theo NDV HA.
Ngoài ra, mô phổi và thận từ mỗi của 28 con gà
nghiệm nhiễm APMV-1 / gà / Switzerland / Safnern / 95
và gà xúc nhiễm tám đã được phân tích cùng một lúc bởi RTPCR
và phân lập virus trong trứng có phôi.
Allantoic chất lỏng hoặc vắc-xin. So sánh NDV chuẩn độ trong allantoic
chất lỏng sử dụng như tiêm chủng cho các thí nghiệm thời gian khóa học, có chứa
APMV-1 / gà / Switzerland / Safnern / 95, được thực hiện bằng RT-PCR
và bằng cách cấy trong trứng gà có phôi như đã được mô tả.
Hơn nữa, pha loãng gấp mười lần hàng loạt các loại vắc-xin (TAD NĐ VAC LaSota
và TAD NĐ vac HitchnerB1, theo các nhà sản xuất
đặc điểm kỹ thuật có chứa ít nhất 109 EID50 trên 1000 liều nhiễm)
được sử dụng để xác định độ nhạy của RT-PCR.
Ngoài ra, thu hoạch allantoic chất lỏng từ trứng có phôi,
tiêm vắc-xin hoặc TAD NĐ vac LaSota hoặc APMV-
1 / gà / NorthernIreland / Ulster / 2C, và các mẫu mô từ gà
nghiệm nhiễm APMV-1 / gà / Switzerland / Safnern /
95, được phân tích trong hai lần pha loãng loạt bởi HA hoặc RT-PCR
cho NDV. Các ống được so sánh.