(B) Scratch assay on transfected ce

(B) Scratch assay on transfected cells
(i) Plate growing cells at 50–60% confluency for 12–18 h before transfection. Transfect cells with the plasmid encoding the gene of interest (or siRNA) along with a marker plasmid (i.e., GFP) in a 7:1 ratio, or with a vector-encoding GFP fusion protein containing the gene
of interest by LipofectAmine and PLUS transfection reagents (Invitrogen). Incubate the dishes at 371C until cells reach 100% confluence to form a monolayer.
(ii) Use a p200 pipet tip to create a scratch of the cell monolayer. Wash the plate once and replace with the desired medium.If time-lapse microscopy is used, CO
2-independent media (e.g., HEPES-buffered media) may be required. The time-lapse
microscope is used for acquiring the images from the same field automatically. It can be equipped with a stage incubator either with only temperature control or with both temperature and CO2control. For the chamber with only temperature control, it is necessary to use CO2-independent medium during the assay. Nonetheless, it is not very practical to examine cell migration over a period of over 18 h by using the CO2-independent medium.
(iii) Observe the cells under a fluorescence microscope to ensure that enough cells in the leading edge of the scratch are positively transfected (i.e., as marked by GFP). Create reference markings as described in Step 6 and acquire both phase-contrast and fluorescence images every 2 h for the same scratched region until the scratch completely close or
within a desired time frame.
(iv) Determine the rate of cell migration for the transfected cells by the available computing software that measures the distance traveled during the desired time frame (see Step A(v)). It should be noted that the neighboring untransfected cells could be used as controls for the positively transfected cells. It is also useful to draw an imaginary line in the middle of the scratch in the images captured (seeFig. 2).

Kết quả (Việt) 1:

(B) đầu khảo nghiệm ngày transfected tế bào(i) mảng phát triển tế bào tại 50-60% confluency cho 12-18 h trước khi transfection. Transfect tế bào với plasmid mã hóa các gen của quan tâm (hoặc siRNA) cùng với một plasmid đánh dấu (ví dụ, GFP) ở một tỷ lệ 7:1, hoặc với một vector mã hóa GFP phản ứng tổng hợp protein có genquan tâm bởi LipofectAmine và cộng với thuốc thử transfection (Invitrogen). Ấp cho nở các món ăn tại 371C cho đến khi tế bào đạt được 100% hợp lưu để tạo thành một monolayer.(ii) sử dụng một p200 pipet Mẹo để tạo ra một đầu di động monolayer. Rửa sạch các tấm một lần và thay thế với các phương tiện bạn muốn. Nếu thời gian trôi đi các kính hiển vi được sử dụng, CO2-độc lập phương tiện truyền thông (ví dụ như, HEPES-đệm truyền thông) có thể được yêu cầu. Các thời gian-trôikính hiển vi được sử dụng để có được những hình ảnh từ cùng một lĩnh vực tự động. Nó có thể được trang bị với một vườn ươm giai đoạn với chỉ kiểm soát nhiệt độ hoặc nhiệt độ và CO2control. Đối với buồng với chỉ kiểm soát nhiệt độ, nó là cần thiết để sử dụng phương tiện truyền thông độc lập CO2 trong các khảo nghiệm. Tuy nhiên, nó không phải là rất thực tế để kiểm tra di động di chuyển trong một khoảng thời gian hơn 18 h bằng cách sử dụng các phương tiện độc lập CO2.(iii) quan sát tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang để đảm bảo rằng các tế bào đủ ở rìa hàng đầu của đầu tích cực transfected (tức là, như được đánh dấu bởi GFP). Tạo dấu hiệu tham chiếu như mô tả trong bước 6 và có được cả hai giai đoạn-tương phản và huỳnh quang hình ảnh mỗi 2giờ cho giống trầy xước vùng cho đến khi đầu hoàn toàn đóng hoặctrong một khung thời gian mong muốn.(iv) xác định tỷ lệ di động di chuyển cho các tế bào transfected bởi phần mềm máy tính có sẵn các biện pháp khoảng cách đi du lịch trong một khung thời gian mong muốn (xem bước A(v)). Cần lưu ý rằng các tế bào lân cận untransfected có thể được sử dụng như điều khiển cho các tế bào transfected tích cực. Nó cũng có ích để vẽ một đường tưởng tượng ở giữa đầu trong những hình ảnh bị bắt (seeFig. 2).

Kết quả (Việt) 2:

(B) Scratch khảo nghiệm trên tế bào transfected
(i) Máy phát triển các tế bào ở 50-60% confluency cho 12-18 giờ trước khi thâm chuyển. Tế bào Transfect với các plasmid mã hóa các gen quan tâm (hay siRNA) cùng với một plasmid marker (tức là, GFP) trong 7: 1 tỷ lệ, hoặc với một protein GFP fusion vector mã hóa có chứa các gen
quan tâm bởi LipofectAmine và PLUS transfection thuốc thử (Invitrogen). Ủ các món ăn tại 371C cho đến khi tế bào đạt 100% hợp lưu để tạo thành một lớp đơn.
(ii) Sử dụng một mẹo P200 Pipet để tạo ra một vết xước của lớp tế bào. Rửa tấm một lần và thay thế với các kính hiển vi medium.If thời gian trôi đi mong muốn được sử dụng, CO
2 phương tiện truyền thông độc lập (ví dụ, HEPES đệm phương tiện truyền thông) có thể được yêu cầu. Thời gian trôi đi
, kính hiển vi sử dụng cho việc mua các hình ảnh từ các lĩnh vực tương tự. Nó có thể được trang bị với một lồng ấp giai đoạn hai với chỉ kiểm soát nhiệt độ hay với cả nhiệt độ và CO2control. Đối với các thính phòng với chỉ kiểm soát nhiệt độ, nó là cần thiết để sử dụng phương tiện CO2 độc lập trong xét nghiệm. Tuy nhiên, nó không phải là rất thiết thực để kiểm tra di cư tế bào trong khoảng thời gian hơn 18 h bằng cách sử dụng các phương tiện truyền CO2 độc lập.
(iii) Quan sát các tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang để đảm bảo rằng các tế bào đủ trong phần đầu của mẻ đang tích cực transfected (tức là, như đánh dấu bằng GFP). Tạo dấu tài liệu tham khảo như đã mô tả ở bước 6 và có được cả hai giai đoạn tương phản và hình ảnh huỳnh quang mỗi 2 h cho các khu vực bị xước cùng cho đến khi đầu hoàn toàn gần hoặc
trong một khoảng thời gian mong muốn.
(iv) Xác định tỷ lệ di cư tế bào cho các tế bào transfected bởi phần mềm máy tính có sẵn để đo khoảng cách đi trong khung thời gian mong muốn (xem Bước A (v)). Cần lưu ý rằng các tế bào lân cận untransfected có thể được sử dụng như điều khiển cho các tế bào transfected tích cực. Nó cũng hữu ích để vẽ một đường tưởng tượng ở giữa của đầu trong các hình ảnh chụp (seeFig. 2).