2.1 Phương pháp
1. Chuẩn bị dung dịch agarose trong điện đệm ở một nồng độ thích hợp để tách các mảnh vỡ kích thước cụ thể dự kiến trong các mẫu DNA (s). 2. Nếu sử dụng một chai thủy tinh, mất nắp. Đun nóng hỗn hợp trong một bồn tắm nước sôi hoặc lò vi sóng cho đến khi tan hết agarose. 3. Sử dụng găng tay cách điện để chuyển bình vào một cốc nước ở 55 ° C. Khi gel tan chảy đã nguội, thêm ethidium bromide để nồng độ cuối cùng là 0,5 mg / ml. Trộn dung dịch gel triệt để bằng những vòng xoáy nhẹ nhàng. 4. Trong khi các giải pháp agarose được làm mát, chọn một chiếc lược phù hợp để tạo thành các khe mẫu trong gel. Vị trí của lược 0,5-1,0 mm ở trên tấm để một cũng hoàn toàn được hình thành khi agarose được thêm vào khuôn. 5. Đổ dung dịch agarose ấm áp vào khuôn. 6. Cho phép các gel polymer hóa hoàn toàn (20-45 phút ở nhiệt độ phòng), sau đó đổ một lượng nhỏ điện đệm trên đầu trang của các gel, và cẩn thận lấy chiếc lược. Đổ ra khỏi bộ đệm điện và cẩn thận tháo băng. Gắn kết các gel vào bể điện di. 7. Đặt gel vào các thiết bị điện và các bộ đệm đủ điện để trang trải các gel đến độ sâu khoảng. 1 mm. 8. Trộn mẫu bằng cách nạp thuốc nhuộm với một khẩu phần 1: 5 hoặc 1:10. 9. Từ từ nạp hỗn hợp mẫu vào các khe của gel ngập bằng cách sử dụng một micropipette dùng một lần, một micropipettor tự động, hoặc một kéo dài Pasteur pipette hoặc ống kính mao mạch. Tiêu chuẩn kích thước tải vào khe trên cả hai bên phải và bên trái của gel. 10. Đóng nắp bể gel và đính kèm các dẫn điện để các DNA sẽ di chuyển về phía cực dương dương (chì đỏ). Áp dụng một điện áp của 1-5 V / cm. Nếu các đạo đã được gắn chính xác, bong bóng sẽ được tạo ra ở cực dương và cực âm, và trong vòng vài phút, các bromophenol màu xanh nên di chuyển từ giếng vào cơ thể của gel. Chạy gel cho đến khi bromophenol xanh và xylene cyanol FF đã di cư cho khoảng cách thông qua việc thường xuyên để phần ba cuối og gel. 11. Khi các mẫu DNA hoặc thuốc nhuộm đã di cư cho khoảng cách đủ lớn thông qua các gel, tắt điện hiện và loại bỏ các khách hàng tiềm năng và nắp từ các bồn chứa gel. Nếu không, vết gel bằng cách ngâm nó trong bộ đệm điện hoặc H2O có chứa ethidium bromide (0,5 mg / ml) cho 20-45 phút ở nhiệt độ phòng hoặc bằng cách ngâm trong 1: 10.000 lần pha loãng dung dịch SYBR Green điện đệm.
3. Phát hiện của DNA trong gel agarose
axit Nucleic chạy trên một điện có thể được phát hiện bằng cách nhuộm bằng thuốc nhuộm và hình dưới ánh sáng UV 300 nm. Nhuộm và trực quan của DNA được thực hiện bằng cách sử dụng một trong hai ethidium bromide hoặc SYBR Green. Các phương pháp thuận tiện nhất và thường được sử dụng để hình dung DNA trong agarose gel là ethidium bromide. Ethidium bromide có thể được sử dụng để phát hiện acid nucleic cả đơn và kép (cả DNA và RNA). Tuy nhiên, độ phân giải của axit nucleic sợi đơn là tương đối thấp và năng suất huỳnh quang là nghèo so với SYBR Green. Trong thực tế, hầu hết huỳnh quang kết hợp với nhuộm DNA sợi đơn RNA hoặc là do ràng buộc của các thuốc nhuộm để song lập intrastrand ngắn trong các phân tử (Sambrook & Russel 2001).
Các mô hình dải của DNA được giải quyết thông qua các gel bởi những hình ảnh ghi lại. Hình ảnh của ethidium bromide nhuộm gel có thể được chụp bằng cách dùng truyền tải hoặc ánh sáng tới UV.
Www.intechopen.com
nguyên tắc điện di gel và Khái niệm cơ bản
40
Tuy nhiên, số lượng nicking của DNA là thấp hơn nhiều ở 302 nm so với bước sóng 254 nm. Nếu SYBR xanh được sử dụng thay vì ethidium bromide khác tăng 10-20 lần trong sự nhạy cảm bằng cách sử dụng hình ảnh thông thường dùng kỹ thuật này là ở tầm mức có thể. Phát hiện ADN nhuộm với màu này đòi hỏi việc sử dụng một gelatin hoặc giấy bóng kính lọc màu vàng hoặc màu xanh lá cây với các máy ảnh cùng với sự chiếu sáng với ánh sáng 300-nm UV.
4. Tài liệu tham khảo
Blasiak J, Trzeciak A, Malecka-Panas E, Drzewoski J & Wojewódzka M (2000). Trong genotoxicity vitro của ethanol và acetaldehyde trong tế bào lympho con người và tiêu hóa cells.Toxicology niêm mạc đường tiêu trong ống nghiệm 14 (4): 287-295. Boffey, SA (1984). Phân lập DNA cao phân tử trọng lượng, trong phương pháp Sinh học phân tử, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, JM, ed.), Humana, totowa, NJ, 333-341. Brody, JR & Kern, SE (2004). Lịch sử và nguyên tắc của phương tiện truyền thông dẫn điện dùng cho điện DNA chuẩn. Anal Biochem. 333 (1): 1-13. Corley, RB (2005). Hướng dẫn về các phương pháp trong các ngành khoa học y sinh. ISBN: 0-387-22845-4 Harrington, RE (1993). Các nghiên cứu về DNA uốn và linh hoạt sử dụng gel- electrophoresis.Electrophoresis. 14,732-746. Jin X., Yue S., Wells KS & Singer VL (1994). SYBR Green: I. Một nhuộm huỳnh quang mới optomized để phát hiện các khoản picogram của DNA trong gel. Biophys. J., 66, p. A159. Lodge J, Lund P. & Minchin S. (2007). Gene cloning: nguyên tắc và các ứng dụng. ISBN 0- 7487-6534-4. Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesyan MD & Kushnirov VV (2003). Men [PSI +] prion uẩn này được hình thành bởi các polyme Sup35 nhỏ phân chia do Hsp10. Journal of Biological Chemistry.278 (49): 49636. Lane, D., Prentki, P. & Chandler, M. (1992). Sử dụng gel chậm phát triển để phân tích protein tương tác axit nucleic. Nhận xét về vi sinh. 56,509-528. Lewis M. Agarose gel electrophoresis (phương pháp cơ bản). Giao thức sinh học. Lấy 2011. Lu Y & Morimoto K. (2009). Là uống rượu thường xuyên kết hợp với giảm di cư DNA điện di trong bạch cầu máu ngoại vi từ ALDH2- Japanes thiếu nam. Đột biến. 24 (4): 303-308. Madruga MH, Moscatello DK, Emlet DR, DIETERICH R & Wong AJ (1997). Grb2 liên kết dính trung gian phosphatidylinositol 3-kinase kích hoạt và thúc đẩy các tế bào sống của yếu tố tăng trưởng nevre. Proc. Natl. Acad. Sci.Vol. 94, pp. 12.419-12.424 Rapley R., (2000). Các giao thức axit nucleic cuốn sổ tay. ISBN 0-89603-459-3. Sahoo L. (2007). Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật. hướng dẫn sử dụng. Sambrook J & Russel DW (2001). Cloning phân tử: Một thứ 3 Manual Phòng thí nghiệm Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. Sharp PA, Sugden B. & Sambrook J. (1973). Phát hiện hai hoạt động hạn chế endonuclease trong Haemophilus parainfluenzae bằng phân tích agarose-ethidium bromide điện. Hóa sinh. 12: 3055-3063. http://www.molecularstation.com/agarose-gel-electrophoresis/ http://ocw.mit.edu/courses/biological-engineering/20-109-laboratory-fundamentals-in- sinh học-kỹ thuật-thu-2007 / các phòng thí nghiệm / mod1_2 / http://rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Agarose_Gel_Electrophoresis
www.intechopen.com
Gel điện di - Nguyên tắc và Khái niệm cơ bản Sửa bởi Tiến sĩ Sameh Magdeldin
ISBN 978-953-51-0458-2 bìa cứng, 346 trang Nhà xuất bản Intech đăng trực tuyến 04, Tháng Tư, 2012 đăng trong ấn bản in April, 2012
Đại học Intech Âu Campus STeP Ri Slavka Krautzeka 83 / A 51000 Rijeka, Croatia Điện thoại: 385 (51) 770 447 Fax: 385 (51) 686 166 www.intechopen.com
Intech Trung Quốc Đơn vị 405, Văn phòng Block, Hotel Equatorial Shanghai số 65, Yan An Road (West), Thượng Hải, 200.040, Trung Quốc Điện thoại: + 86-21-62489820 Fax: + 86-21-62489821
Hầu hết sẽ đồng ý rằng gel electrophoresis là một trong những trụ cột cơ bản của sinh học phân tử. Thuật ngữ được đặt ra này bao gồm vô số các phương pháp tách gel dựa trên dựa chủ yếu vào phân tử sinh học cất phân đoạn dưới dòng điện di dựa chủ yếu vào khối lượng phân tử. Trong cuốn sách này, các tác giả đã cố gắng trình bày nguyên tắc cơ bản đơn giản hóa của tách gel dựa trên cùng với các ứng dụng của kỹ thuật exemplarily đa năng này. Chúng tôi cố gắng để giữ cho nội dung của cuốn sách rõ nét và toàn diện, và hy vọng rằng nó sẽ nhận được sự quan tâm quá nhiều và mang lại lợi ích và thông tin có giá trị cho độc giả.
Làm thế nào để tham khảo Để tham khảo cách chính xác công trình học thuật này, cảm thấy miễn phí để sao chép và dán sau đây: Muhittin Yılmaz, Cem Ozic và İlhami Gok (2012). Nguyên tắc của Acid nucleic Tách bằng Agarose Gel điện di, gel điện di - Nguyên tắc và khái niệm cơ bản, tiến sĩ Sameh Magdeldin, ISBN (Ed.): 978-953-51- 0458-2, Intech, có sẵn từ: http: //www.intechopen .com / cuốn sách / gel electrophoresis-nguyên-và- cơ bản / nguyên tắc-of-nucleic-acid-ly-do-agarose gel electrophoresis-
đang được dịch, vui lòng đợi..