d) Collections and submission of sa

d) Collections and submission of samples
Where possible, specimens for primary diagnosis should be collected during acute infection, and should be processed as soon as possible. Ideally, transportation systems should be selected to ensure that specimens arrive at the laboratory within 24 hours. If prompt examination for Cryptosporidium cannot be carried out, the deterioration of protozoan morphology and their overgrowth by other microorganisms, particularly yeasts, can be reduced by the addition of 10% aqueous (v/v) formalin, although 10% formalin can interfere with PCR tests. Both oocyst morphology for microscopic identification and sporozoite DNA for PCR testing can usually be preserved for long periods at 4°C without formalinisation. Faeces can be stored frozen for over 2 years without affecting the ability to extract Cryptosporidium DNA for molecular analysis. In some instances, this can enhance DNA extraction rates, possibly due to the softening of the outer oocyst wall. Repeated freeze– thawing of frozen faecal samples is not recommended as the released DNA will degrade.
The procedures used for collection and transport of specimens are critically important for successful laboratory analyses. Specimens should be collected in a suitable leak-proof sample container and should be enclosed in secure primary and secondary packaging. Procedures for packaging and shipping of specimens must be as outlined in the International Air Transport Association’s Dangerous Goods Regulations (16). These regulations are summarised in Chapter 1.1.1 Collection and shipment of diagnostic specimens.
e) Threshold of detection in faeces
Most tinctorial and fluorescence methods for detecting oocysts, and ELISA and IC for detecting Cryptosporidium antigens, are relatively insensitive. These methods can detect oocysts in clinically ill animals, but may not be sufficiently sensitive to detect infection in clinically normal animals. Anusz et al. (2) reported a detection limit of 106 oocysts per ml of faeces using the Kinyoun modification of mZN on unconcentrated faecal smears. Concentrating oocysts in the sample can increase the sensitivity of detection. In oocyst-positive human stool samples, between 1 × 104 and 5 × 104 oocysts per g of unconcentrated stool are necessary to obtain a 100% detection efficiency using the Kinyoun mZN staining method (41). Variations in faecal consistency influence the ease of detection, with oocysts being more easily detected in concentrates made from watery, diarrhoeal specimens than from formed stool specimens (41). In addition to microscopic techniques, a number of antigen-capture ELISAs and ICs have been reported in the literature with detection limits in the region of 3 × 105–106 oocysts per ml (2, 29, 37), which indicates that they do not appear to offer increased sensitivity over microscopical methods.
In bovine faecal samples, oocysts were not detected in samples seeded with 10,000 C. parvum oocysts per g following formol–ether sedimentation and examination using AP or immunofluorescence (IF) staining. When oocysts were concentrated using sucrose flotation, the threshold of detection was 4000 oocysts per g for both staining methods. After salt flotation, 4000 oocysts per g could be reliably detected by AP staining, but the detection limit was increased to 6000 oocysts per g using IF staining (41). Webster et al. (42) also compared microscopy with PCR and found that PCR coupled with immunomagnetic particle separation (IMS) of oocysts from faecal samples detected five oocysts per ml of diluted faeces, which corresponds to 80–90 oocysts per g. Even allowing for the dilution of formed faecal samples required for IMS, this represented an increase in sensitivity of several orders of magnitude over the conventional coprodiagnostic methods. Currently, a variety of sensitive, PCR-based tests are available (see Section B.1 Nucleic acid recognition methods).

Kết quả (Việt) 1:

d) bộ sưu tập và nộp hồ sơ mẫu Nếu có thể, các mẫu vật để chẩn đoán chính nên được thu thập trong quá trình nhiễm cấp tính, và nên được xử lý càng sớm càng tốt. Lý tưởng nhất, Hệ thống giao thông vận tải nên được lựa chọn để đảm bảo rằng mẫu vật đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Nếu các xét nghiệm nhanh chóng cho Cryptosporidium không thể được thực hiện, sự suy thoái của protozoan hình thái học và phát triển quá mức của họ bởi các vi sinh vật, đặc biệt là nấm men, có thể được giảm bằng cách bổ sung 10% dung dịch (v/v) formalin, mặc dù 10% formalin có thể can thiệp với các xét nghiệm PCR. Cả hai hình thái oocyst để xác định vi và sporozoite DNA thử nghiệm PCR có thể thường được bảo quản trong thời gian dài ở 4° C mà không formalinisation. Phân có thể được lưu trữ đông lạnh trong hơn 2 năm mà không ảnh hưởng đến khả năng trích xuất Cryptosporidium DNA cho phân tích phân tử. Trong một số trường hợp, điều này có thể nâng cao tỷ lệ chiết DNA, có thể do làm mềm các bức tường bên ngoài oocyst. Lặp đi lặp lại đóng băng-tan băng của frozen faecal mẫu không được khuyến cáo như DNA phát hành sẽ làm suy thoái. Các thủ tục được sử dụng cho bộ sưu tập và vận chuyển của mẫu vật là cực kỳ quan trọng đối với phân tích phòng thí nghiệm thành công. Mẫu vật nên được thu thập trong một thùng chứa mẫu leak-proof phù hợp và nên được đính kèm trong các bao bì an toàn của tiểu học và trung học. Quy trình đóng gói và vận chuyển của mẫu vật phải như đã nêu trong quy định hàng hóa nguy hiểm International Air Transport Association (16). Các quy định này được tóm tắt trong bộ sưu tập chương 1.1.1 và lô hàng chẩn đoán mẫu vật. e) ngưỡng phát hiện trong phân Đặt tinctorial và sự phát huỳnh quang phương pháp để phát hiện oocysts, và ELISA và IC để phát hiện kháng nguyên Cryptosporidium, là tương đối không nhạy cảm. Những phương pháp này có thể phát hiện oocysts lâm sàng bệnh động vật, nhưng có thể không đủ nhạy cảm để phát hiện các nhiễm trùng ở động vật bình thường lâm sàng. Anusz et al. (2) báo cáo một giới hạn phát hiện của 106 oocysts mỗi ml của phân sử dụng sửa đổi Kinyoun mZN trên unconcentrated faecal smears. Tập trung oocysts trong mẫu có thể tăng độ nhạy của phát hiện. Trong các mẫu phân của con người oocyst tích cực, giữa 1 × 104 và 5 × 104 oocysts / g của unconcentrated phân là cần thiết để có được một phát hiện 100% hiệu quả bằng cách sử dụng Kinyoun mZN staining phương pháp (41). Các biến thể trong sự nhất quán faecal ảnh hưởng dễ phát hiện, với oocysts được phát hiện dễ dàng hơn trong tập trung làm từ chảy nước, chảy mẫu hơn từ mẫu vật được hình thành phân (41). Ngoài ra để kính hiển vi kỹ thuật, một số kháng nguyên-chụp ELISAs và ICs đã được báo cáo trong các tài liệu phát hiện giới hạn vùng 3 × 105-106 oocysts mỗi ml (2, 29, 37), mà chỉ ra rằng họ không xuất hiện để cung cấp tăng độ nhạy hơn phương pháp microscopical. Trong mẫu faecal bò, oocysts đã không được phát hiện trong các mẫu hạt với 10.000 C. parvum oocysts / g sau formol-ether lắng và kiểm tra bằng cách sử dụng AP hoặc immunofluorescence (nếu) nhuộm. Khi oocysts đã được tập trung sử dụng Sucroza nổi, ngưỡng phát hiện là 4000 oocysts mỗi g cho cả hai phương pháp staining. Sau khi muối nổi, 4000 oocysts trên g đáng tin cậy có thể được phát hiện bởi AP nhuộm, nhưng giới hạn phát hiện đã tăng lên đến 6000 oocysts mỗi g sử dụng nếu nhuộm (41). Webster et al. (42) cũng so kính hiển vi với PCR và thấy rằng Đảng Cộng sản Romania cùng với immunomagnetic hạt chia tách (IMS) của oocysts từ faecal mẫu phát hiện năm oocysts mỗi ml phân pha loãng, tương ứng với 80-90 oocysts trên g. Thậm chí cho phép các pha loãng thành lập faecal mẫu cần thiết cho IMS, điều này đại diện cho tăng ở độ nhạy cảm của một số đơn đặt hàng của các cường độ qua các phương pháp thông thường coprodiagnostic. Hiện nay, một loạt các xét nghiệm nhạy cảm, PCR trên có sẵn (xem phần B.1 axit Nucleic công nhận phương pháp).

Kết quả (Việt) 2:

d) Bộ sưu tập và nộp mẫu
Nếu có thể, mẫu vật để chẩn đoán chính phải được thu thập trong quá trình nhiễm cấp tính, và cần được xử lý càng sớm càng tốt. Lý tưởng nhất, hệ thống giao thông nên được lựa chọn để đảm bảo rằng các mẫu đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Nếu kiểm tra nhắc cho Cryptosporidium không thể được thực hiện, sự suy thoái của hình thái sinh vật đơn bào và phát triển quá mức của họ bởi các vi sinh vật khác, đặc biệt là nấm men, có thể được giảm bằng cách cho thêm 10% dung dịch nước (v / v) formalin, mặc dù 10% formalin có thể can thiệp với PCR kiểm tra. Cả hai hình thái kén hợp tử để xác định vi và DNA thoi trùng để thử nghiệm PCR thường có thể được bảo quản trong thời gian dài ở 4 ° C mà không formalinisation. Phân có thể được lưu trữ đông lạnh trong hơn 2 năm mà không ảnh hưởng đến khả năng trích xuất Cryptosporidium DNA để phân tích phân tử. Trong một số trường hợp, điều này có thể nâng cao tỷ lệ chiết DNA, có thể là do làm mềm tường kén hợp tử bên ngoài. Lặp đi lặp lại tan băng đá-lạnh của mẫu phân đông lạnh không được khuyến cáo như là DNA phát hành sẽ làm suy giảm.
Các thủ tục được sử dụng để thu thập và vận chuyển mẫu vật là cực kỳ quan trọng cho phân tích trong phòng thí nghiệm thành công. Mẫu vật phải được thu thập trong một container mẫu rò rỉ thích hợp và cần được kèm theo trong bao bì sơ cấp và thứ cấp an toàn. Thủ tục để đóng gói và vận chuyển mẫu vật phải được như được nêu trong hàng hóa nguy hiểm quy định của Hiệp hội Vận tải Hàng không Quốc tế (16). Các quy định này được tóm tắt trong Chương 1.1.1 Thu thập và vận chuyển mẫu vật chẩn đoán.
E) Ngưỡng phát hiện trong phân
Hầu hết các phương pháp thuộc về thuốc nhuộm và huỳnh quang để phát hiện kén hợp và ELISA và IC để phát hiện kháng nguyên Cryptosporidium, là tương đối không nhạy cảm. Những phương pháp này có thể phát hiện kén hợp tử ở động vật bị bệnh lâm sàng, nhưng có thể không đủ nhạy cảm để phát hiện nhiễm ở động vật bình thường về mặt lâm sàng. Anusz et al. (2) báo cáo một giới hạn phát hiện của 106 oocyst mỗi ml phân bằng cách sử dụng sửa đổi Kinyoun của MZN trên smears phân unconcentrated. Tập trung kén hợp trong mẫu có thể làm tăng độ nhạy phát hiện. Trong phân người kén hợp tử dương, giữa 1 × 104 và 5 × 104 oocyst mỗi g phân unconcentrated là cần thiết để có được một hiệu quả phát hiện 100% bằng phương pháp nhuộm Kinyoun MZN (41). Những biến đổi trong tính thống nhất phân ảnh hưởng đến sự dễ dàng phát hiện, với oocyst là dễ phát hiện được trong các chất cô đặc làm từ nhiều nước, mẫu vật tiêu chảy hơn từ các mẫu phân lập (41). Ngoài các kỹ thuật kính hiển vi, một số xét nghiệm ELISA kháng nguyên-chụp và IC đã được báo cáo trong các tài liệu với giới hạn phát hiện trong khu vực của 3 × 105-106 oocyst mỗi ml (2, 29, 37), mà chỉ ra rằng họ không xuất hiện để cung cấp tăng độ nhạy cảm hơn các phương pháp kính hiển vi.
trong mẫu phân trâu, bò, kén hợp không được phát hiện trong các mẫu hạt giống số với 10.000 oocyst C. parvum mỗi g sau formol-ether lắng, kiểm tra sử dụng (IF) nhuộm AP hoặc miễn dịch huỳnh quang. Khi kén hợp tử được tập trung sử dụng nổi sucrose, ngưỡng phát hiện là 4000 oocyst mỗi g cho cả hai phương pháp nhuộm. Sau khi tuyển nổi muối, 4000 oocyst mỗi g có thể dễ phát hiện bởi AP nhuộm, nhưng các giới hạn phát hiện đã tăng lên đến 6000 oocyst mỗi g sử dụng NẾU nhuộm (41). Webster et al. (42) cũng so sánh với kính hiển vi PCR và thấy rằng PCR kết hợp với tách hạt immunomagnetic (IMS) của kén hợp tử từ mẫu phân được phát hiện năm oocyst mỗi ml của phân pha loãng, tương ứng với 80-90 oocyst mỗi g. Thậm chí cho phép các độ pha loãng của mẫu phân lập cần thiết cho IMS, điều này thể hiện sự gia tăng độ nhạy cảm của vài bậc so với các phương pháp thông thường coprodiagnostic. Hiện nay, một loạt các, kiểm tra PCR nhạy cảm có sẵn (xem Phần B.1 nucleic phương pháp nhận dạng acid).